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FISH技術(shù)作為非放射性檢測體系，具有以下優(yōu)點

1、熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；

2、探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用；

3、實驗周期短、能迅速得到結(jié)果、特異性好、定位準確；

4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；

5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；

6、既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。

　　FISH技術(shù)是一種非放射性分子遺傳學(xué)實驗技術(shù)，其基本原理是將直接與熒光素結(jié)合的寡聚核苷酸探針或采用間接法用生物素、地高辛等標記的寡聚核苷酸探針與變性后的染色體、細胞或組織中的核酸按照堿基互補配對原則進行雜交，經(jīng)變性—退火—復(fù)性—洗滌后即可形成靶DNA 與核酸探針的雜交體，直接檢測或通過免疫熒光系統(tǒng)檢測，最后在熒光顯微鏡下顯影，即可對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。
　　FISH技術(shù)有以下幾點優(yōu)勢：

① 安全、快速、靈敏度高；

② 探針能較長時間保存；

③ 多色標記，簡單直觀；

④ 可用于中期染色體及間期細胞的分析；

熒光原位雜交技術(shù)問世于70年代后期，其曾多用于染色體異常的研究，近年來隨著FISH所應(yīng)用的探針鐘類的不斷增多，特別是全Cosmid探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn)，使FISH技術(shù)不僅在細胞遺傳學(xué)方面，而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究，如基因診斷基因定位等 。原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點，諸如每次檢驗均 需重新標記探針，已標記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時間的曝光時間和對環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時，需要較多的分裂進行統(tǒng)計學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數(shù)上的誤差等。與之比FISH則具有：

①操作操作簡便，探針標記后穩(wěn)定，一次標記后可使用二年；

②方法敏感，能迅速得到結(jié)果；

③在同一標本上，可同時檢測幾種不同探針；

④不僅可用于分裂期細胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于間期細胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究等特點。

熒光原位雜交技術(shù)是一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的，二者經(jīng)變性-退火-復(fù)性，即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛，可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，經(jīng)熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

FISH選用的標本可以是分裂期細胞染色體也可以是間期細胞．間期細胞可以是冰凍切片，也可以是細胞滴片或印片。生物素（Biotin），地高辛（digoxigenin），dinitrophenyl（DNP），aminoacetyl fluorine（AAF）等均可用于探針標記。前兩者較為常用，通常采用切口平移法（Nick translation）或隨機引物法（Random Primer）對探針標記。在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下也可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標探針。通常 用于Biotin 標記的探針應(yīng)大于1000bp以下的探針，不易標記成功。對PCR技術(shù)來標記。近年來，Vysis 公司成功的生產(chǎn)些大片段的DNA探針（100-400kb）。由于控針較長故可將熒光物質(zhì)直接標記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進一步簡化，而且雜交信號更強。如探針是具有重復(fù)序列的DNA或粘粒、YAC探針，在雜交液中加上用超聲斷碎的人體胎盤組織DNA或Cot DNA,以陰斷探針和染色質(zhì)之間非特異性的結(jié)合。

熒光信號在高壓汞燈產(chǎn)生的短波激發(fā)光下常引起熒光信號淬滅的發(fā)生，可將DAPI或PI稀釋于P-phenlenediomine的甘油緩沖液中。任何熒光顯微鏡均可用于觀察FISH信號，但對單拷貝探針的信號需要質(zhì)量較好的熒光顯微鏡。如采用雙色或多色濾光片可以同時觀察FITC、Texas-Red等多種顏色的FISH信號，不論是染色體還是單拷貝基因的FISH信號均可用高度敏感和高分辨率的彩色膠片攝取，也可通過CCD（charge coupled device）的照相系統(tǒng)或Laser Scanning Confocal Imaging System（激光掃描共焦成像系統(tǒng)）將攝取的信號儲存在計算機內(nèi)，經(jīng)軟件處理后，將信事情顯示在熒光屏上。由于有多種方法標記DNA探針，故一次雜交可以同時 觀察多個探針的信號，如兩個不同的探針分別用Biotin和Digoxigenin標記，雜交后用avidin-FITC和抗-Dig-Texas-Red分別與探針上的Biotin 和Digoxigenin結(jié)合，應(yīng)用雙色濾光片，在顯微鏡下就可以同時看見帶有綠色熒光的FITC和紅色熒光的Texas-Red信號。同理，采用三種或三種以上不同的半抗原，如Biotin,DIG和DNP等標記探針，然后用多種不同顏色的熒光素，如FITC（綠色），Rhodamine（紅色），AMA或Cascade Blue（藍色）等結(jié)合抗體進行檢測，可同時得到多種不同顏色的熒光信號，如采用不同的排列組合，最多可同時檢測7種不同的探針。由于常規(guī)的熒光顯微鏡的照像系統(tǒng)，彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標探針的應(yīng)用，使用Digital Imaging Camera System或CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲存在計算機內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運用軟件系統(tǒng)事例各次得到的影像，最終形成一個復(fù)合的多顏色的圖像。

此外，對已做過G顯帶的染色體片子用75%酒精或甲醇褪色后，可再做FISH這樣可更清晰的辨認各條染體及染色色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的易位，插入，倒位等）FISH和G顯帶技術(shù)結(jié)合不僅可以用新近G帶處理過的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。

FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結(jié)合，可以更精確地描述原必于染色體長短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體梳型或復(fù)制片段的性質(zhì)。FISH和細胞免疫化這技術(shù)結(jié)合，可以同時用多種顏色反應(yīng)檢測不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個細胞內(nèi)同時找到基因的位點，轉(zhuǎn)錄和翻譯和產(chǎn)物，有助于對核甙酸結(jié)構(gòu)與功能以及基因表達產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。在基因圖譜繪制中，F(xiàn)ISH和Linkage mapping結(jié)合起來，即使對具有高度多形態(tài)的基因位點也能較精確地定下來。

在細胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是α衛(wèi)星DNA、β-衛(wèi)星DNA和經(jīng)典衛(wèi)星DNA探針。α衛(wèi)星DNA探針主要檢測人染色體的著絲粒。β衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及號染色體的異染色體質(zhì)周圍.經(jīng)典衛(wèi)星DNA（classic-saiellite DNA）有著AATGG短片段重復(fù)，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長臂異染色質(zhì)周圍。后兩種探針除去可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細改變的檢查。三種探針產(chǎn)生的熒光信號都在染色體著絲?；蚋?，因此常用于鑒定，羊水細胞可不培養(yǎng)直接作FISH檢查，發(fā)現(xiàn)在21三體（Down氏綜合征）、18三體（Edward綜合征）、13體（Patau 綜合征）、45XO（Turner氏綜合征）和47XXY（Klinfelter綜合征）。

FISH在白血病方面和應(yīng)用較為方泛的是慢性粒細胞白血病bcr/abl易位DNA探針，采用Digoxigenin標記于22號染色體上的bcr基因，用Biotin標記位于9號染色體上的Abl基因，然后用紅綠二種不同顏色的熒光素檢測，慢粒常有染色體易位t（9；22）（q34；q11）而引起bcr和Abl基因的融合，這時不需要檢測分裂中期細胞，在間期細胞中就可以見到二種顏色訊號的混合，從而可以確定是Ph陽性細胞。這特別適合化療后緩解的CML，極易發(fā)現(xiàn)殘存的白血病細胞。其它如t（15；17）易位DNA探針，t（18；21）易位DNA探針分別可用于急性早幼粒白血?。ˋPL）和急性粒細胞白血?。ˋML）的診斷。此外在白血病的診斷方面，還有等位17號染色體長臂iso(17q),16號染色體長臂間倒位inv（16）探針等，都有商業(yè)出售。

在實體腫瘤方面，應(yīng)用較為廣泛的是HER-2/neu基因探針。乳腺癌細胞中Her/2-neu基因的擴增常預(yù)示著患者預(yù)后較差。在FISH技術(shù)之前的所有測定基因擴增的方法，都是采用經(jīng)典的分子生物學(xué)方法South blotting等），但這些方法與FISH相比，不僅費時費力，而且也不可能在細胞水平上觀察到基因擴增的狀態(tài)。FISH技術(shù)的更大優(yōu)點是可以在間期細胞核上觀察到DNA擴增的直接證據(jù)，而且間期細胞核所顯示出的擴增DNA熒光信號其數(shù)量多少及熒光強度常與DNA擴增的水平有關(guān)。1998年美國政府FDA批準了作為基因治療的一種單克隆抗體Herceptin，可配合化療來治療部分晚期轉(zhuǎn)移性乳腺癌病人，約25-30%的乳腺癌病人有HER-2/neu基因的擴增和/或過度表達。這部分病人適合Herceptin治療、FDA在此前一些時候批準了Vysis公司的HER-2/neu基因DNA探針在乳腺癌臨床診斷上的應(yīng)用。HER-2/neu基因的擴增或過表達也見于卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、涎腺腫瘤及胃癌等惡 性腫瘤?？梢灶A(yù)，在不久的將來Herceptin和HER-2/neu基因DNA探針可用于這些腫瘤的治療和診斷。其它一些實體瘤的腫瘤的腫瘤基因的探針如N-myc,C-myc,CyclinD1等雖有商業(yè)出售，但目前還未用于臨床。

染色體x,y,21,18和13的數(shù)量變化常與先天性疾病有關(guān)。采用染色體著絲粒重復(fù)序列DNA作為探針，可以確定分裂細胞或間期細胞這些染色體的數(shù)目止，如采用21號染色體的涂抹（painting）探針，根據(jù)標記區(qū)域的大小可檢測出Down氏綜合征的發(fā)生。

實體腫瘤的染色體研究比較困難，這是由于獲取足夠量的分裂期腫瘤細胞比較困難。使用染色體著絲特異探針，對間期細胞進行染色體數(shù)量變異分析，可獲得較好的結(jié)果。因此FISH技術(shù)十分有助于腫瘤細胞遺傳細胞遺傳學(xué)的研究。Hopman采用FISH技術(shù)研究膀胱癌，發(fā)現(xiàn)9號染色體的丟失。FISH檢測的結(jié)果與流式細胞儀分析的結(jié)果完全一致。Waldman等發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目的改變和腫瘤的分化及分期有著密切關(guān)系，如7號染色體嗇常見于有較高的Brdard分級和有較高的PCNA標記指數(shù)的晚期、惡性度高的腫瘤。Waldman認為這一現(xiàn)象可涉及到7號染色體上某些特殊基因的表達增加或被抑制。采用多種染色體探針，以不同的顏色標記，更適合于實體腫瘤染色體數(shù)目改變的異質(zhì)性研究。

對于G或Q顯帶難以確定的染色體結(jié)構(gòu)改變，運用FISH技術(shù)可以幫助解決。許多不能歸類的標記染色體，F(xiàn)ISH技術(shù)可以確定畸變的來源，如Miura等報告21例非小細胞肺癌（NSCLC）的染色體改變，其中一例有2個標記染色體，用FISH檢測后證實是來自9號染色體的短臂梁色體上微細帶的丟失，普通顯帶常不易發(fā)現(xiàn)，用特定的基因探針檢測時，在正常應(yīng)該有熒光信號的部位如不出現(xiàn)信號，表示有染色體的丟失。Lux等用Ankyrin基因作探針，檢測遺傳性球殂紅細胞增多癥病人的染色體和間期細胞，發(fā)現(xiàn)有這個基因的缺失。Taguchi等采用靠近3p21帶附近的6個不同位點的探會，比較異常和正常3號染色體，確定胸膜間皮瘤有3p21帶的缺失并推測這個區(qū)域可能存在重要的抑癌基因，為了進一步的分子生物學(xué)研究提供了重要線索。選擇按一定順序排列的基因探針，可以幫助確定染色體倒位，尤其是臂間倒位的性質(zhì)，如急性白血病有16號染色體的倒位，選擇兩個分別位于斷裂點近端和遠端的粘粒探針，同時用16號染色體著絲位探針，正常細胞熒光信號的次序是：粘粒-粘粒-著絲粒，而白血病細胞的信號的次改變?yōu)檎沉?著絲粒-粘粒。

雜交細胞通常是含有單個人類染色體嚙齒動物細胞。這種雜交細胞常用于繪制基因圖譜或生產(chǎn)單個染色體特DNA庫。雜交細胞在培養(yǎng)過程中，人體染色體極易丟失或發(fā)生染色體重排，因此，需要對雜交細胞定期進行細胞遺傳學(xué)檢查，采用人體組DNA作為探針或相應(yīng)人體染色體涂抹探針，可以很主便的檢測這些改變。

采用FISH技術(shù)，不僅可以直接確定某一DNA鏈在染色體上的位置，而且誚用多種顏色熒光素的標記控針，還提供了一個簡單的確定基因順序的方法?？捎貌煌伾珶晒馑貥擞泝蓚€不同的DNA鏈，而且他們在染色體上的距離大于1Mbp時，可以依據(jù)不同探針信號的排列關(guān)系分辨他們在染色體上的順序。采用5-Burd處理的細胞，可以獲得高分辨顯帶的染色體，從而增加DNA鏈標記到染色體上的分辨能力。如果使用間期細胞，兩個DNA鏈的距離可以縮短至50Kbp，這個間距是染色體上的分辨距離的二十分之一。不同探針的次序可以通過測量其間期細胞的距離來確定。

確定DNA鏈在染色體上精細位置，適用于檢查某些特殊的染色體易位和缺失，如涉及11號染色體q23的易位常見于急性白血t（4；11）見于急性淋巴細胞白血?。ˋLL），t（6；11)，5（9；11）見于急性粒細胞白血?。ˋML），t（11；19）見于急淋和急粒兩種白血病。

標記同一DNA鏈與不同種必細胞的染色體雜交，可以找出不同種屬之間的同源基因以及基因在染色休上的位置，從而了解種屬之間的進化關(guān)系。

DNA擴增通常表現(xiàn)為異常的顯帶區(qū)域（ABRS）或異染質(zhì)區(qū)（HSRS）以及無著絲微小體（DM），這些基因擴增的細胞遺傳學(xué)表現(xiàn)在許多惡性腫瘤中。搞清楚腫瘤細胞中物定DNA鏈（基因）的擴增，有助于了解腫瘤的惡性增生過程。在腫留細胞中某些腫瘤因(Oncogene)的擴增，可作為預(yù)測腫瘤進展及預(yù)后的臨床指征。如FISH能有效地在染色體上定位擴增的特定DNA，特別是當細胞遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)在HSR或ABRS來源及位置，推測可能擴增的腫瘤基因，從而有目的檢測某些基因，并能很快得到直接清晰的基因擴增的信息。Cherif等在結(jié)腸腺癌細胞中，采用FISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)C-myc的擴增，而且C-myc擴增鏈是重排在19號染色體的長臂上。染色體上策細帶的丟失，普通顯帶不易發(fā)現(xiàn)，用特定的基因探針檢測時，在正常應(yīng)該有熒光信號的部位如不出現(xiàn)信號，表示有染色體的丟失。用Ankyrin基因作探會，檢測遺傳性球殂紅細胞增多癥病人的染色體和間期細胞，發(fā)現(xiàn)有這個基因的缺失。有學(xué)者用FISH技術(shù)在37例B細胞淋巴瘤中發(fā)現(xiàn)21例（56.8%）存在6q23-24的缺失，故認為這一改變對淋巴瘤診斷有實際應(yīng)用值。